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응용자료 | Protein Purification-6X His (polyhistidine) Tag: Ni-NTA Column

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작성자 최고관리자 작성일17-06-30 10:48 조회16,498회 댓글0건

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Protein Purification-6X His (polyhistidine) Tag: Ni-NTA Column



① 원리: Ni-NTA Agarose와 재조합 6X His 단백질의 6X His와의 높은 친화도를 이용한 정제 방법이다.

② Ni-NTA Agarose: nitrilotriacetic acid (NTA), 6% agarose matrix, tetradentate chelating ligand로 구성되어 있다. NTA는 4개의 functional group을 가지고 있기 때문에 Ni2+가 붙게 된다.

③ Native & Denaturing conditions

  - Native condition: 타겟 단백질이 수용성으로 supernatant에 존재하는 단백질의 활성을 유지하기 위해 사용하는 condition이다.

  - Denaturing condition: 다겟 단백질이 불용성으로 pellet에 존재하는 단백질을 정제하기 위해 사용하는 condition이다.

[Ni-NTA Purification Method]

​① Buffer Preparation: Tris와 HEPES가 포함된 buffer 조성으로 buffer의 농도는 일반적으로 20-100 mM이다.

② Buffer 조성

Buffer  

Condition I 

Condition II 

 Buffer A

20 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM NaCl 

 50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl​

 Buffer B

20 mM Tris-HCl, pH 8.0 

10 mM NaCl

20 mM Imidazole​

50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

20 mM Imidazole 

 Buffer C

20 mM  Tris-HCl, pH 8.0

10 mM NaCl

100 m​M Imidazole

 50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

100 mM Imidazole​

 Buffer D

20 mM Tris-HCl, pH 8.0

10 mM NaCl

250 mM Imidazole​

50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

250 mM Imidazole 

 

[Ni-NTA Column 준비]

​① Ni-NTA Agarose를 여러 번 tapping 하거나 inverting 한다.

② 정제 column (직경 2.5 cm)에 resin (Ni-NTA Agarose) 10 ml을 넣고 5-10분 놓아둔다. Resin이 가라앉으면 supernatant를 제거한다.

③ 3배 vol.의 D.W를 넣고 resin을 가볍게 두드려 resuspending 하고 약 5-10 분 후 resin이 가라앉으면 supernatant를 제거한다.

④ ②번 step을 반복한다.

⑤ 3배 vol.의 binding buffer (Buffer A)를 넣고 resin을 가볍게 두드려 resuspending 하고 약 5-10분 후 resin이 가라앉으면 supernatant를 제거한다.

⑥ ②번 step을 반복한다.

[Ni-NTA Purification process: Native Condition]

​① Equilibration: column의 3-5배 vol.의 binding buffer (Buffer A)를 흘려준다.

② Sample binding: column에 샘플을 넣어준다.

③ Column의 10배 vol.의 wash buffer (buffer B)를 흘려준다. 흘러나온 buffer를 2개의 50 ml tube에 모은다. (Wash 1, Wash 2)

④ Elution buffer (Buffer C,D)로 단백질을 elution 한다. Buffer C를 column에 4회 흘린 후 흘러나온 각 buffer를 4개의 tube에 모은다. 이 후 buffer D를 buffer C와 동일하게 흘린 후 4개의 tube에 모은다. (Elution 1-8)

⑤ Elution 한 샘플은 SDS-PAGE에서 확인한다.

* Elution fraction은 4혹은 -20 에 보관해야 한다. 오랜 시간 보관하는 경우 protease inhibitor를 첨가한다.

[Ni-NTA Purification process: Denaturing Condition]

​E.coli system을 이용하여 재조합 단백질을 발현, 정제하였을 때 단백질이 insoluble aggregate 형태로 변형이 되는 경우가 있다. (Inclusion body) Inclusion body protein은 6 M GuHCl이나 8M UREA 같은 denaturing condition에서 soluble하게 변할 수 있다. Denaturing condition에서 단백질의 6X His tag이 완전하게 노출되고 Ni-NTA와 결합하여 효과적인 정제가 가능하다. 그러나, 변성 된 단백질이 본래의 상태와 다른 특성을 가지고 있기 때문에 단백질의 renaturing 및 refolding 과정을 거쳐야 한다.

★ Denaturing Buffer 조성

 Buffer

조성 

 Denaturing Buffer A

50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

8 M Urea 

 Denaturing Buffer B

 50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

8 M Urea

20 mM Imidazole​

 Denaturing Buffer C

50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

8 M Urea

100 mM Imidazole 

 Denaturing Buffer D

 50 mM NaH2PO4, pH 8.0

300 mM NaCl

8 M Urea

250 mM Imidazole​

 

​① Denaturing condition에서의 단백질 정제 준비: Denaturing buffer A 40 ml을 샘플에 넣고 1 시간 동안 상온에서 denature 시킨다.

② 새로운 tube로 상층액을 옮긴 후 15,000 rpm에서 30 분간 원심분리 한다.

③  Equilibration: Ni-NTA column을 준비하고 column의 3-5배의 binding buffer (Denaturing buffer A)를 column에 흘려준다.

④ Sample binding: column에 샘플을 넣어준다. Column을 통과한 샘플은 새로운 tube에 모은다. (Flowthrough)

⑤ Column의 10배 vol.의 wash buffer (Denaturing Buffer B)를 column에 흘려주고, 흘러나온 buffer는 2개의 50 ml tube에 모은다 (Wash 1, Wash 2)

⑥ Elution buffer (Denaturing Buffer C, D)로 단백질을 elution 한다. Buffer C를 column에 4회 흘린 후 흘러나온 각 buffer를 4개의 tube에 모은다. 이 후 buffer D를 buffer C와 동일하게 흘린 후 4개의 tube에 모은다. (Elution 1-8)

⑦ Elution 한 샘플을 SDS-PAGE에서 확인한다.

* Denaturing buffer에 포함 된 8 M Urea는 낮은 온도에서 crytallization ​되기 때문에 elution fraction은 실온에 보관해야 한다.