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응용자료 | Protein Purification-GST (Glutathione-S-Transferase) Tag: GSH column

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작성자 최고관리자 작성일17-06-30 11:07 조회11,400회 댓글0건

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​​Protein Purification-GST (Glutathione-S-Transferase) Tag: GSH column

 

① 원리: GST fusion protein과 reduced form glutathione (GSH)와의 affinity를 이용하는 affinity chromatography method이다. GST는 dimer 형태로 GSH와 binding 하는 단백질이다. GST fusion protein은 GST가 buffer에 포함 된 고농도의 GSH와 binding 하기 때문에 column을 통과하는 GSH가 포함 된 elution buffer에서 GST fusion protein이 elution 된다. 이 정제 방법은 GST 단백질 특성에 의해 정제되기 때문에 non-denaturing condition에서만 정제가 가능하다.

 정제 후 GST fusion protein에서 site-specific protease를 사용하여 GST와 target protein을 분리할 수 있다.

[GST Fusion Protein Purification Method]

​Buffer preparation: GST fusion protein의 정제는 2가지 종류의 buffer를 사용한다.

 Buffer

Condition I 

Condition II 

Buffer A 

20 mM Tris-Cl, pH 8.0

10 mM NaCl

1 mM EDTA 

1X PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH 7.4) 

 Buffer B

50 mM Tris, pH 8.0

10 mM GSH 

50 mM Tris, pH 8.0

10 mM GSH 

 

[GST Fusion Protein-GSH Column Purification Method]

​① Column을 준비한다.

② Equilibration: column의 3-4배 vol.의 binding buffer (Buffer A condition)를 column에 흘려준다.

③ Sample binding: column에 sample을 넣어준다. Column에서 흘러나온 sample을 새로운 tube에 모은다. (Flowthrough)

④ Column의 10배 vol.의 wash buffer (Buffer A)를 column에 흘려준다. column에서 빠져나온 fraction은 새로운 tube에 모은다 (Wash 1, Wash 2)

⑤ Elution buffer (Buffer B)로 protein을 elution 시킨다. 총 4회 반복하고 column을 통과학 fraction은 새로운 tube에 각각 모은다. (Elution 1-5)

⑥ 각 fraction은 SDS-PAGE에서 확인한다.