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응용자료 | Protein Purification-Gel Filtration

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작성자 최고관리자 작성일17-06-30 13:53 조회9,863회 댓글0건

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Protein Purification-Gel Filtration



Gel filtration은 protein size의 차이​를 이용하여 protein을 정제하는 방법이다. 이 방법은 protein이 chromatography의 media와 결합하지 않기 때문에 buffer가 protein의 분리 정도에 직접 영향을 주지 않는다는 점에서 ion exchange나 affinity chromatography 방법과는 차이가 있다. Gel filtration 방법은 co-factor, detergent, urea, guanidine, hydrochloride 등이 protein 정제에 필요하다. 따라서 gel fliltration은 pH 수준, 이온의 강도 및 co-factor의 농도 변화에 민감한 단백질을 분리하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

① Group separation

샘플의 buffer를 변화시켜 작은 분자의 group을 빠르게 제거하여 정제하는 group 분리 방법이다. 과량의 염이나 small molecule을 분리하는데 효과적이다. Group separation 방법은 protein 정제 진행 중 탈염 또는 buffer 교환을 진행할 수 있다.

②​ High Resolution Fractionation

​Size 차이에 따라 protein을 분리하는 방법이다. High resolution fractionation의 목적은 하나 이상의 protein을 분리하는 것으로, 별도의 정제 방법을 사용하여 비슷한 크기의 protein을 먼저 제거하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있다. 일반적으로 protein 정제 과정 중 마지막 단계에서 진행한다. 

Gel filtration에 사용하는 media는 superdes, sephacryl, superpose 가 있으며, 실험 목적이나 reslution 등에 따라 선택한다.

Type 

Characteristic 

Component 

 Superdex

 · High level of analysis

 · Fast analysis rate

​ · High recovery rate

 · Covalent bond complex of dextra and high cross-linked agarose: high physical and chemical stability.

 · Viscous dluents such as 6-8 M urea can be used.​

 Sephacryl

 · High level of analysis

 · Fast analysis rate

 · High recovery rate

 · Large scale analysis possible 

 · Cross-linked product of allyl dextran and N, N'-methylene bis-acrylamide.

 ·​ High stability due to hydrophilic matrix.

 · Viscous eluents such as 6-8 M urea can be used.​

 Superose

 · Wide fractionation range

 · Inappropriate for large scale analysis​

 · Highly cross-linked porous agarose particles

 · Viscous eluents such as 6-8 M urea can be used.​

* Buffer used: 20 mM HEPES, pH 7.5 / 150 mM NaCl / 1 mM EDTA

[Sephacryl Column Purification Method]

​① Sample preparation: sample을 전체 colulmn의 0.5-4% vol.으로 농축한 후 0.22-0.45  filter를 이용하여 filtering 한다.

② Column preparation: column을 sephacryl S 100 HR, S 300 HR로 packing 한다. (직경 2.5 cm, 높이 100 cm / 약  500 ml)

③ Equilibration: column을 통해 30 cm/h의 속도로 buffer를 흘려준다.

④ Sample binding: column에 준비 한 sample을 흘려준다. 샘플 일부를 SDS-PAGE 확인용으로 남겨둔다. (Input)

⑤ Buffer로 protein fraction을 얻는다.

     Setting: 1 fraction à​ 0.5 ml/분 X 10 분

     각 fraction 별로  tube에 sample을 모은 후 SDS-PAGE로 확인한다.