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응용자료 | Monoclonal Antibody Production (Mouse Monoclonal Antibody)

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작성자 최고관리자 작성일17-06-30 14:31 조회10,266회 댓글0건

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Monoclonal Antibody Production (Mouse Monoclonal Antibody)


Monoclonal antibody를 만들기 위해서는 항원에 대한 항체를 만들어 내는 B cell이 필요하다. B cell은 항원을 면역한 mouse의 spleen에서 얻을 수 있다. 주로 사용하는 항원 종류는 protein과 peptide이며 필요한 항원양은 일반적으로 100 -200 ng이다. 저분자의 protein은 낮은 항원성을 갖기 때문에, KLH​, BSA나 OVA과 같은 carrier protein과 conjugation하여 사용한다.

항원을 mouse에 면역 후, spleen cell과 myeloma cell을 fusion 시킨다. SP2/0-Ag14은 Balb/c mouse의 spleen cell과 fusion 하는데 가장 일반적으로 사용하는 myeloma cell이다.SP2/0 의 부족한 hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT)의 특성을 이용하여 hybridoma cell을 선택할 수 있다.

Hybridoma cell을 선택하기 위해, nucleic acid production 방법이 사용된다. Nucleic acid production에는 2 가지 다른 방법이 있는데 하나는 de novo pathway이고 다른 하나는 salvage pathway이다. Myeloma cell에는 hyposanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT)가 부족하기 때문에 HAT (Hypoxanthine, aminopterin, thymidine) 배양 배지에서 융합 된 세포만일 선택하게 된다.

[Monocloanl Antibody Production Method]

​① CFA를 섞은 항원을 female Balb/c의 복강에 주입한다.

② 1차 boosting: 4주 후, IFA를 섞은 항원을 mouse에 면역한다.

③ 2주 후 mouse의 꼬리에서 serum을 얻어 ELISA 방법으로 항체의 titer를 측정한다.

④ 2주 후,mouse에 PBS에 녹여 있는 같은 양의 항원을 면역한다.

⑤ 3일 후, mouse에서 spleen을 적출한다. Culture media로 spleen을 씻어낸 후 cell을 분리한다.

⑥ PEG를 사용하여 mouse에서 분리한 cell과 myeloma 인 SP2/0를 fusion 시킨다.

⑦ 1X HAT culture media로 fusion 된 cell을 찾기 위해 culture를 진행한다.

⑧ ELISA test 후 24 well로 positive cell (fusion이 된 cell)을 이동시킨다. (culture 조건:7-10 days,  CO2 incubator 37℃)

⑨ Culture를 반복하면서 positive cll을 찾아낸다.