Ammonium sulfate precipitation은 protein을 간단하게 정제하는 비특이적인 정제 방법이다. Protein의 극성 그룹과 이온성 그룹이 buffer에서 물과 수소 결합을 형성하는데, ammonium sulfate와 같은 작은 이온을 첨가하면 protein에서 물 분자가 제거되면서 침전되는 원리를 이용한다.

​

[Ammonium sulfate precipitation method]

​① Ascites를 4℃, 30분 동안 3,000 rpm에서 원심분리 후 새로운 flask에 supernatant를 옮긴다.

② 항체가 들어있는 flask를 ice에 놓고 saturated ammonium sulfate (final conc. 25%) 1/3 vol.을 천천히 넣고 약 2-4시간 동안 교반한다.

③ 4℃, 30분 동안 8,000 rpm에서 원심분리 한다.

④ 항체가 들어있는 flask를 ice에 놓고 saturated ammonium sulfate (final conc. 50%)1/3 vol.을 천천히 넣고 약 2-4시간 동안 교반한다.

⑤ 4℃, 30분 동안 8,000 rpm에서 원심분리 한다.

⑥ Supernatant는 별도 보관하고 pellet은 건조시킨다.

⑦ 1X PBS (50% of original vol.)을 넣어 pellet을 녹인다. 

⑧ Dialysis tube로 옮기고 1X PBS로 4℃, 30분간 교반한다.

⑨ PBS를 교체하고 4℃에서 1 시간동안 교반한다.

⑩ 2X PBS (Appx. 100 vol.)로 교체하고 4℃에서 밤새 교반한다.

     DEAE Chromatography purification을 할 때는 10 mM Tris-HCl, pH 8.5 완충액을 사용한다.​

⑪0.03% thimerosal을 첨가하고 -70℃에서 얼린다.

​

[Ammonium sulfate saturation method]

① Ammonium sulfate 80g을 100 ml D.W에 녹인다. (약 4.1 M)

    약한 가열을 통해 녹인다.​

② 실온에서 녹인 ammonium sulfate를 식힌다.

③ NH₄OH 또는 H₂SO₄를 넣어주면서 pH 7.0을 맞춘다.

④​ Filtering 후 4℃에 보관한다.

​